科研 | 中国科学院：养殖成年尼罗河罗非鱼新品种中鳃和胃肠微生物群的分类和功能特征及其与肠代谢物的关系（国人佳作）

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编译：微科盟提提子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读
尼罗河罗非鱼是中国和东南亚最常养殖的罗非鱼，其集约化养殖给人类创造了巨大的经济价值，但同时也造成了各种疾病，尤其是细菌性疾病，导致了相当大的经济损失。近年来，通过增加益生菌的应用来预防鱼类疾病已成为水产养殖的共识。为了更好地筛选宿主相关益生菌，我们需要对养殖罗非鱼的鳃和胃肠道黏膜特异性微生物群进行深入研究。本研究通过16S rRNA测序和非靶向气相色谱/质谱(GC/MS)代谢组学技术，对人工养殖的成年新品种尼罗河罗非鱼的鳃、胃肠黏膜和消化相关微生物区系以及肠道代谢物谱进行分析，结果表明成年新品种尼罗河罗非鱼的胃肠道微生物区系的多样性、结构、组成和预测功能在胃肠道区域和样本类型上有显着性差异(Welcht检验；p<0.05)，该结果为在罗非鱼饮食中有效应用目标益生菌或益生元调节养殖罗非鱼的营养和健康提供了参考依据。

论文ID

原名：Taxonomicand Functional Characteristics of the Gill and Gastrointestinal Microbiota and Its Correlation with Intestinal Metabolites in NEW GIFT Strain of Farmed Adult Nile Tilapia (Oreochromis niloticus)译名：养殖成年尼罗河罗非鱼新品种中鳃和胃肠微生物群的分类和功能特征及其与肠代谢物的关系
期刊：Microorganisms
IF：4.152发表时间：2021.03通讯作者：李爱华
通讯作者单位：中国科学院水生生物研究所

实验设计

1.样本收集：从4个池塘（每个池塘有3条鱼）随机抽取了12只大小差不多(平均体重0.24±0.02kg)的成年尾鱼。在无菌条件下，收集罗非鱼的鳃丝(G)、胃含物(S)、胃黏膜(W)、肠道内容物(C)和肠黏膜(M)，同一池塘的三条鱼鳃丝、胃含物、胃黏膜、肠道内容物、肠黏膜作为一个样本。鳃丝、胃黏膜和肠黏膜被共同视为黏膜样本，胃和肠的内容物被统称为消化样本。

2.  用基因组提取试剂盒将所有样本的DNA提取出来，并进行PCR扩增，随后使用DNA凝胶提取试剂盒纯化PCR产物，经Qubit和qPCR定量后，通过 IlluminaMiseq平台进行16S rRNA测序。

3. 从肠道内容物样本中提取和检测代谢物，并准备质控（QC）样品进行质控分析，将其余的样品通过Agilent 7890A GC系统和 Agilent 5975C inert MSD 进行非靶向气相色谱/质谱(GC/MS)代谢组学测序，并使用自动解卷积与鉴定系统（AMIDS）搜索代谢物的注释信息。

4. 将获得的生物信息学数据进行α-多样性、β-多样性、主坐标、ANOSIM、LDA、PICRUSt、KEGG通路注释等分析。

实验结果

1. 细菌群落的多样性和结构
在对原始数据进行质量过滤后，我们从20个样本中获得了262861个有效读数，经过随机重采样，保留序列被聚类成487个OTUS。样本中的覆盖率从98.58%-99.78%(99.43%±0.40%；表S1)，稀疏曲线趋于平稳水平，Shannon曲线稳定（图S1A，B）。这些结果表明，样品中存在的大多数微生物多样性被检测到了。统计分析表明，用OTUS和Chao1的丰富度估计量和Shannon>Simpson的多样性指数(图1A-D；表S1)评价三种黏膜样品(G、M和W)的细菌群落丰富度和多样性无显著性差异(Welch t检验；p>0.05)。值得注意的是，丰富度和多样性指数表明，黏膜样品的细菌群落的丰富度和多样性值明显低于消化道样品(C和S)(图1A-D；表S1)。此外，胃内容物的细菌群落比肠道内容物的细菌群落多样性丰富(图1A-D；表S1)。图1 不同部位细菌群落α多样性指数的比较
(A)不同部位细菌群落细菌指数比较。(B)不同部位细菌群落Shannon指数比较。(C)不同部位细菌群落Chao指数比较。(D)不同部位细菌群落Simpson指数比较。较高的Sobs值和Chao值表示较高的丰富度；较高的Shannon值和较低的Simpson值表示较高的多样性。两个位点之间的统计学意义分别为*p<0.05、*p<0.01和*p<0.001。G：鳃粘液(G1-G4)；C：肠内容物(C1-C4)；M：肠粘液(M1-M4)；S：胃内容物(S1-S4)；W：胃粘液(W1-W4)。 我们进行多因素统计分析，比较不同部位细菌群落的整体结构。ANOSIM显示在任何两个胃肠部位之间的细菌群落结构均存在显著性差异(p=0.034)(表S2)。 PcoA图可视化了ANOSIM的结果，显示了四个胃肠道部位中细菌群落存在明显分离(图2A)。总的来说，从PCoA获得的两个主坐标解释了所有样本之间59.56%的变化。有趣的是，鳃和胃黏膜之间的细菌群落中没有显著差异(R=0.0417，p=0.497)(表S2和图2A)。在OTU水平上的分层聚类树表明，肠道内容物样本中的细菌群落首先聚集在一个分支中，然后与胃含量样本聚集在一起，而鳃和胃黏膜样本聚集在一起，形成另一个分支(图2B)。图2 不同部位的细菌群落结构分析
（A）基于细菌群落Bray-Curtis度量的主坐标分析。百分比表示主成分的相对贡献。（B）基于细菌群落Bray-Curtis度量的层次聚类树。G：鳃粘液(G1-G4)；C：肠内容物(C1-C4)；M：肠粘液(M1-M4)；S：胃内容物(S1-S4)；W：胃粘液(W1-W4) 2. 细菌群落的分类学组成
我们将所有样本序列的系统发育分类分为27个细菌门、64纲、132目、184科、258属和487个OTU（表S1）。在门水平上，Proteobacteria（变形菌门）是所有样本中最丰富的门类，占分类序列总数的33.00%-95.35%(图3A)。Actinobacteria（放线菌门）和Firmicutes（厚壁菌门）是鳃黏膜、肠内容物和胃黏膜的第二大门类。胃内容物样本有Bacteroidota（类杆菌）和Cyanobacteria（蓝细菌），而肠黏膜样本有Fusobacterias（梭杆菌）、Proteobacteria和Deinococcota。此外，通过将黏膜样本与消化样本进行比较，我们发现黏膜样本中的Proteobacteria明显富集（<0.05），而Bacteroidota、Cyanobacteria、Verrucomicrobia和Chloroflflexi明显富集（<0.05）（表S3）。值得注意的是，肠道内容物样本中微生物的相对丰度值明显高于胃内容物样本（Welch t-test；p<0.05）。图3 细菌群落在所有20个样品中的分布在(A)门水平或(B)属水平
 G：鳃粘液(G1-G4)；C：肠内容物(C1-C4)；M：肠粘液(M1-M4)；S：胃内容物(S1-S4)；W：胃粘液(W1-W4)。 在属水平上，鳃和胃黏膜中的细菌群落以Sphingomonas（鞘氨醇单胞菌属）和Ralstonia（罗尔斯通菌属）为主，其次是未分类的Comamonadaceae (丛毛单胞菌属)、Pelomonas、Methylobacterium-Methylorubrum、Amnibacterium（胺杆菌属）和Roseomonas（玫瑰单胞菌属）(图3B)。在所有肠道样本中，包括肠道内容物和黏膜在内，均以Undibacterium（无歧杆菌属）、Escherichia-Shigella（埃舍里奇-志贺氏菌）、Paeniclostridium和Cetobacterium为主(图3B)。胃中细菌类群数量最大，主要类群包括无分级的Chitinophagaceae、无分级的chloroplast、无分类的Comamonadaceae和无分类的Verrucomicrobia（疣微菌属），其次是未分类的Rhodocyclaceae（红环菌属）和Cetobacterium（图3B）。
3. 不同位置细菌群落的差异
在OTU水平上的共现网络分析（相对丰度≥0.5%）区分了五个位点之间的微生物区系。鳃和胃黏膜中的细菌群落与肠内容物、黏膜和胃内容物中的细菌群落是分开的。在鳃和微生物之间的细菌群落中，大多数优势OTUS为共用的，暗示这两个位置具有相似的核心物种，包括Sphingomonas aquatilis、Ralstoniapickettii、Roseomonas gilardii、未分类的 Comamonadaceae、Methylobacterium-Methylorubrum,、Pelomonas、Amnibacterium、Staphylococcus（葡萄球菌属） (图S2和表S4)。胃中的核心种属 Chitinophagaceae、Verrucomicrobia、Chloroplast、Comamonadaceae、Novosphingobium和Cetobacterium。虽然肠道内容物和黏膜具有不同的核心物种，但在这两个部位之间发现了一些共有的细菌物种，包括Undibacterium、Escherichia-Shigella和Paeniclostridium（图S2和表S4）。我们进一步证实了在不同位置的样本存在不同的OTU。LEfSe确定了胃内容物和黏膜之间的35个鉴别特征(LDA评分>3.5)，其中28个OTU的胃含量显著丰富（见图4A）。相反，胃黏膜中只有7个OTU明显富集（见图4A）。在肠道内容物样本中，Escherichia-Shigella OTU206和Undibacterium OTU173在肠道黏膜中显著富集，而一些OTUs在肠道内容物中显著富集，包括来自Gammaproteobacteria和Candidatus Competibacter的几个OTUs、Cetobacterium的OTU126、Rhizobiales Incertae Sedis sp.的OTU75、Arenicellaceae sp. OTU10和Sarcina（八联球菌属）OTU76(图4B)。通过对两种消化样品的比较，我们发现7种OTUs属于Undibacterium，Paeniclostridium，SZB30，Candidatus Competibacter和Rhizobiales Incertae Sedis，并且它们均在消化样品中显著富集，而23种优势OTUs在胃内容物样品中显著富集，包括属于 Chitinophagaceae、Verrucomicrobia、Comamonadaceae、Novosphingobium和Chloroplast的OTUs(图5A)。通过对黏膜样品与消化样品的比较，我们发现5个属于Pelomonas,、R. pickettii、Comamonadaceae和 Staphylococcus的OTU在黏样品中明显富集，而11个OTU在消化样品中明显富集，如 Cetobacterium、Candidatus Competibacter 等 (见图5B)。鳃黏膜样本的特征是以 Comamonadaceae sp. OTU486、R. pickettii OTU490、S. aquatilis OTU488和未分类细菌OTU160（图S3）为优势。胃内容物样本的特征是以Chloroplast的OTU481、Cyanobacteria的OTU374和Cyanobium PCC 6307 的OTU374以及Clostridium sensu 1的OTU344为优势，而胃黏膜样本的特征是R. pickettii 的OTU502和Staphylococcus OTU499为优势（图S3）。肠内容物样本以HOC36亚群 OTU65、OTU15和OTU478、SZB30亚群 OTU87和OTU148，Cetobacterium OTU126和Sarcina OTU147为优势；同时，肠黏膜样本的特征是以Escherichia-Shigella OTU206和气单胞菌OTU199为优势 (图S3)。图4（A）线性判别分析(LDA)效应大小(LefSe)显示，在操作分类单元(OUT)水平上，胃内容物与胃黏膜之间的细菌群落存在差异。（B）在OTU水平上，LefSe显示肠道内容物与肠道黏液样本的细菌群落差异。突出显示的分类群在对应于每种颜色的组中富集。LDA评分可以解释为OTUS相对丰度的差异程度。S：胃内容物(S1-S4)；W：胃粘液(W1-W4)；C：肠内容物(C1-C4)；M：肠粘液(M1-M4)。
 图5 (A)LEfSe显示在胃内容物和内容物之间在OTU水平上细菌群落的差异。(B) LEFSe在OTU水平上显示含量（C和S）和黏膜（G、M和W）样本之间的细菌群落的差异。突出显示的分类群在对应于每种颜色的组中富集。LDA评分可以解释为OTUS相对丰度的差异程度。
 4. 肠道代谢谱及其与肠道微生物的相关性
在本研究中，通过GC/MS分析，在肠道内容物中检测到95种不同的代谢物，包括氨基酸、脂类、碳水化合物、核苷酸和维生素，代谢物分布如图S4所示。以磷酸和亮氨酸为主，其次是异亮氨酸、乳酸、谷氨酸和甘油。Spearman相关热图显示肠道细菌属和代谢物之间存在显著相关（p<0.05）（图6A、B和图7A、B）。Mycobacterium（分支杆菌）和Desulfomonile与鸟氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、9，12-(Z，Z)-十八碳二烯酸、甘油、甲基肌醇、琥珀酸、3-羟基吡啶和腺嘌呤的变化呈负相关。 Alsobacter、Acinetobacter（不动杆菌属）、Turicibacter和Cyanobium PCC-6307与2-羟基戊二酸、高丝氨酸、2-氧异构酸、葡萄糖、尿苷、肌苷和泛酸的变化呈负相关，但与鼠李糖的变化呈正相关。Escherichia-Shigella与丙二酸、2-酮戊二酸、十六烷酸、磷酸、1-单十八烷基甘油、单甲基磷酸、9-(Z)-十六碳烯酸、四癸酸、胆固醇、红糖酸、麦芽糖、甘露糖、木糖、木糖醇、苏氨酸、核糖、核糖醇、尿嘧啶、烟酸、1,3-二叔丁基苯、2,4,6-三叔丁基苯硫醇和苯甲酸的变化呈负相关。 Aeromonas与焦谷氨酸、4-羟基脯氨酸、1-单十六烷基甘油、肌醇、肌醇-1-磷酸、甘油-3-磷酸、富马酸、9、12、15-(Z、Z)-十八碳酸、二十碳酸、甘油酸-3-磷酸、乙二醇酸、苹果酸、葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、山梨醇-6-磷酸、蔗糖和苏糖醇呈负相关；Syntrophus与N-乙酰谷氨酸、4-氨基丁酸、十八酸和花生四烯酸的变化呈负相关，但与半胱氨酸、天冬氨酸和蛋氨酸的变化呈正相关；Sarcina、Pirellula与β-丙氨酸变化呈正相关，2-氨基丁酸变化呈负相关；Undibacterium与鸟氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、9，12-(Z，Z)-十八碳二烯酸、甘油、甲基肌醇、琥珀酸、3-羟基吡啶和腺嘌呤的变化呈正相关；Crenothrix（泉发菌属）、Cetobacterium与尿素、甘油酸、柠檬酸、果糖、丙酮酸、甘露醇、葡萄糖酸和葡萄糖酸的变化呈正相关，但与核糖酸的变化呈负相关；Clostridium sensu stricto 1与二十二碳六烯酸的变化呈负相关。Romboutsia、Methylocaldum（甲基杆菌属）、Desulfobacca和Methylocystis（甲基孢囊菌属）与乳酸的变化呈负相关(图6A、B和图7A、B)。这一发现揭示了肠道代谢物与微生物之间的显著相关性。图6 肠道主要细菌属与代谢物的显著相关性
（A）肠道细菌与氨基酸相关代谢物的相关性。(B)肠道细菌与脂质相关代谢物的关系。相关系数由不同的颜色表示（红色：正相关，蓝色：负相关）。*表示显著的负相关性或正相关性（***p<0.001）。
图7 肠道主要细菌属与代谢物的显著相关性
(A)肠道细菌与碳水化合物相关代谢物的相关性。（B）肠道细菌和其他代谢物的相关性。相关系数用不同颜色表示（红色：正相关；蓝色：负相关）。*表示显著负相关或正相关(***p<0.001)。 5. 细菌群落的功能预测
我们采用PICRUST2分析来预测细菌微生物群的微生物功能，黏膜样本（韦尔奇t试验；p<0.05）NSTI值明显低于消化样本（表S5）。预测鱼黏膜微生物功能的PI CRUST2的准确性明显高于鱼消化。作为比较，人微生物群落项目样本的NSTI值最低（0.03±0.02），而超盐水基质微生物群落样本的NSTI值最高（0.23±0.07），因此，PICRUSt2具有预测鱼黏膜样本的微生物功能的高精度。ANOSIM发现鳃和胃黏膜之间无明显差异（>0.05），但两个部位的预测功能存在显著差异（<0.05）（表S2）。根据KEGG途径分析，所有样本中细菌群落均含有的功能分类分别为代谢（65.64%）、环境信息处理（9.71%）、遗传信息处理（8.90%）和细胞过程（8.08%）（图8）。在KEGG 2级，大部分微生物功能属于碳水化合物代谢、氨基酸代谢、能量代谢、辅助因子和维生素代谢、膜转运和信号转导（图8）。基于平均邻域的函数聚类分析(非加权对群算法(UPGMA)表明，该方法具有较好的聚类效果，将胃黏膜样本聚集在一个分支，然后与肠黏膜样本聚集，而胃和肠内容物样本聚集在另一个分支（图8）。进一步的ANOSIM显示在黏膜和消化样本之间的微生物功能上有显著差异（R=0.8152，对=0.0001）。PCA图揭示了黏膜样本中的微生物功能与消化样本中的微生物功能分离，主要由PC1轴分离，占变异的59.5%（图S5）。通过将黏膜样本与消化样本进行比较，我们发现消化样本中一些微生物功能显著富集，包括全球图和概览图、核苷酸代谢、辅因子和维生素代谢、类萜醇和多酮酸代谢、翻译、折叠、分类和降解、转录和免疫系统（图9）。相反，黏膜样本中与其他氨基酸代谢、异生生物生物降解和代谢、信号转导、细胞运动、循环系统、环境适应和人类疾病相关的预测功能显著富集（图9）。图8 通过PICRUSt2显示细菌群落的功能类别(京都基因和基因组百科全书(KEGG)第1级和第2级)的热图
函数聚类分析是基于非加权对群方法的算术方法(UPGMA)。行表示KEGG正交(KO)函数，列表示20个样本，热图中的颜色强度表示函数类别的相对丰度（%）。G: 鳃黏膜（G1-G4）；C：肠道含量（C1-C4）；M：肠黏膜（M1-M4）；S：胃含量（S1-S4）；W：胃黏膜（W1-W4）。 图9 根据PICRUST2分析预测了细菌群落含量和黏膜样本之间的不同推定功能
行表示21个分化的KEGG正位(KO)函数(校正p<0.05)，图中的条形图表示功能类别的平均比例。95%置信区间反映了平均比例（%）的差异，校正后的p值显示在图的右边。

讨论

由于鱼类复杂的微生物群对鱼类健康具有积极作用而受到人们的广泛关注。然而，养殖尼罗河罗非鱼新品种菌株的细菌群落特征，特别是黏膜相关微生物区系的特征研究仍然很少。在此，我们首先对细菌微生物在鳃含量、胃肠道含量和粘液中的组成和功能进行了分析，并探讨了新品种尼罗非鱼肠道微生物与代谢产物在商业养殖条件下的相关性。我们的研究结果为新品种尼罗河罗非鱼的共生微生物群提供了新的见解，并强调了肠道微生物与代谢之间的相关性。此外，了解特定微生物和肠道代谢物之间的相关性可以为提高这种鱼类的健康和生产力提供理论依据。目前，我们发现不同水生动物的胃肠道的微生物分布不同，包括虾、大西洋鲑鱼、西伯利亚鲟和江豚等，并且同一物种不同组织（皮肤、鳃、肠）的微生物组成和结构也存在明显差异。在本研究中，四个胃肠道部位的微生物群结构明显分离，微生物结构上的显著差异导致了微生物功能的显著差异，这可能归因于胃肠道的功能异质性，因为胃是饮食发酵的主要部位，而后肠在营养吸收中起着重要作用。在胃和鳃黏膜之间的细菌群落结构和组成上没有发现明显的差异，这可能是由于这两个部位之间的黏膜壁龛（确实是这样翻译）的相似性。此外，三个黏膜位点在微生物多样性方面没有显着性差异，并显示出较低的微生物多样性。我们的结果与先前多数研究一致，在不同的鱼类胃肠黏膜部位，微生物多样性没有显著差异。此外，其他研究的结果表明，与消化相关微生物相比，几种鱼类的胃肠黏膜相关微生物区系的丰富度和多样性明显降低，这与我们的结果是一致的。鱼的黏膜上皮细胞可以分泌与黏膜共生微生物群相互作用的免疫因子，从而形成和限制微生物的定植。因此，肠消化液中只有一部分细菌具有定植鱼类黏膜所必需的特性，这一发现可能对解释黏膜微生物多样性有重要意义。然而，最近的一项研究表明，野生罗非鱼在湖泊中的肠道内容物与肠道粘液之间的细菌群落的α和β多样性没有显著差异，主要原因可能是由于湖泊的自然水和养殖水环境，以及鱼类食物来源的差异。在消化样本中，胃内容物比肠道内容物的微生物多样性更高，这与之前对野生罗非鱼、江豚的研究一致。不同的胃肠道区域有不同的物理化学条件，如pH值、氧化还原电位、氧浓度和营养物质的可用性。因此，胃中的许多微生物，特别是需氧微生物，进入肠道后无法存活，从而显著降低肠道内容物中的微生物多样性。本研究旨在提高我们对养殖尼罗河罗非鱼鳃和胃肠道细菌微生物的认识。黏膜样品中细菌的相对丰度明显高于消化样品，我们推测细菌可能在黏膜微生物屏障中起着至关重要的作用。此外，Proteobacteria含有各种机会性病原体，它们的存在可能有助于刺激免疫系统的发展和维持正常免疫功能。作为微生物共生的重要部位，鳃和胃受到的关注较少。研究结果表明，鳃微生物群以Proteobacteria为主，其次是Actinobacteria 和 Firmicutes，这与以往对其他鱼类的研究结果基本一致。这些细菌门在鱼的鳃中普遍存在，据报道，某些细菌物质可参与碳水化合物的运输和蛋白质代谢，这对消化饮食具有重要意义。值得注意的是，肠道内容物样本中存在的Firmicutes的相对丰度明显高于胃内容物样本。Firmicutes的微生物可以产生短链脂肪酸，为肠黏膜细胞提供营养。肠内Firmicutes的富集有助于维持肠黏膜的正常功能和调节肠道微生态环境，肠道中Actinobacteria含量的相对丰度远高于其他部位，放线菌可以产生各种有效的抗生素，可以抑制肠道致病菌的生长，因此，Actinobacteria的富集可能有利于肠道健康。结合上述在结构和多样性上的差异，所有微生物的差异都揭示了罗非鱼微生物群在器官上的生态位分化。鳃和胃黏膜共有核心细菌属主要包括Sphingomonas、Ralstonia、未分类的 Comamonadaceae和 Pelomonas，这些菌属均为有氧微生物。这一研究表明，鳃和胃黏膜都有很高的氧水平，然而我们还需要进一步的研究来解释在本研究中观察到的鳃和胃黏膜微生物群之间的相似性。Sphingomonas是一种革兰氏阴性细菌，其细胞膜由鞘脂类组成，Sphingomonas可以紧密附着在细胞单层并作用于上皮细胞相。人类或哺乳动物的T细胞可以识别Sphingomonas并诱导免疫反应。R. gilardii被认为是一种机会性病原体，可以导致机体严重感染，特别是感染免疫功能低下的人。因此，在鳃和胃黏膜中Sphingomonas、R. gilardii的富集可能在刺激宿主黏膜免疫和对抗病原体定植方面起到重要作用。黏膜样本中R. picketti、Pelomonas和Staphylococcus的相对丰度明显高于消化道样本，这与其他研究结果较为一致，表明R. picketti和Pelomonas是肠道的核心微生物，它们在黏膜中样本的相对丰度明显高于消化道样本。R. picketti、Pelomonas和Staphylococcus是人类黏膜附着微生物组中常见的细菌属。R. picketti是人工海鲈鱼中主要的肠道黏膜微生物，据报道，R. picketti可以产生各种酶，包括甲苯单加氧酶、脂肪酶和解聚酶；有研究表明，Pelomonas参与了多种代谢途径；Staphylococcus可以利用脂肪酸，参与机体代谢。因此，我们推测这三种微生物可能在宿主的黏膜壁龛中发挥重要的代谢作用。在肠道样本中，Undibacterium和Escherichia Shigella在肠黏膜占优势，其丰度明显高于肠内容物样本中的丰度。Undibacterium是一种典型的水生细菌，已在各种淡水环境中被发现，此外，有研究在虾、斑黄鱼和蝙蝠的肠道微生物群中也发现了Undibacterium。据报道，一些Undibacterium属的细菌能产生各种脂肪酸和极性脂质。因此，罗非鱼肠中的Undibacterium可能参与机体脂质代谢，这与肠道代谢物分析结果一致，即Undibacterium与9，12-(Z、Z)-十八二烯酸、甘油和甲基肌醇呈正相关。Escherichia Shigella是鱼类胃肠道中常见的机会性病原体，有研究表明饮食的变化可导致了牛蛙肠黏膜中Escherichia Shigella的减少，同时伴随着牛蛙生长性能和免疫功能的显著降低。此外，我们的结果显示产Aeromonas在肠黏膜中的含量明显高于其他部位，Aeromonas可产生木聚糖酶和纤维素酶。总的来说，Escherichia Shigella和Aeromonas在肠黏膜中显著丰富。Romboutsia可产生直链饱与不饱和脂肪酸，有报道称Romboutsia的物种适应了动物小肠的环境，且有可能参与直链脂肪酸的生物合成。因此，我们推测这些黏膜附着微生物可能与维持宿主黏膜的正常生理功能有关。比较两组消化道样本，我们发现Chitinophagaceae、Verrucomicrobia、 Comamonadaceae、chloroplast在胃内容物样本中显著富集，而Undibacterium、Paeniclostridium、Candidatus Competibacter在肠内容物样本中显著富集。胃中的大多数微生物群是厌氧菌或兼性厌氧菌，Paeniclostridium是肠道内容物样本中丰度较高的属，有研究表明它是蝙蝠肠道中的主要微生物。Cetobacterium在肠道内容物样本中含量丰富，与以往对罗非鱼的研究结果一致。值得注意的是，与胃肠道粘膜相比，Cetobacterium在胃肠道内容物样本中丰富度较高。Cetobacterium广泛分布于淡水鱼的肠道中，它能产生维生素B12，促进碳水化合物的代谢，此外，它还可以促进浮游植物或浮游动物的分解。因此，胃肠道内容中Cetobacterium的富集可能会促进罗非鱼的消化作用。这些微生物的差异均揭示了罗非鱼微生物群在器官上的生态位分化。另一方面，饮食是影响养殖罗非鱼肠道微生物群结构和组成的主要因素。据报道，许多营养因素都影响着宿主肠微生物群的结构，包括氨基酸、脂肪、果糖和葡萄糖。虽然这些营养因素对鱼类肠道微生物群结构的影响受到了广泛的关注，但特定的肠道微生物和代谢物之间的相关性仍不清楚。营养物质是鱼类肠道微生物组的双刃剑，有些营养物质可以形成健康的肠道微生物群，但另一些则可能会导致肠道微生物群的不平衡。因此，我们确定关键营养物质和特定微生物之间的相互作用可能对罗非鱼的疾病干预治疗很重要。短链脂肪酸（SCFAs）是关键的细菌代谢物。SCFAs在罗非鱼的肠内容物中没有发现，这与之前的结果一致，而乳酸是罗非鱼肠道含量中的主要代谢物，与以往的研究一致。乳酸是糖酵解的中间体，可以调节免疫反应和肠黏膜组织再生，据报道，乳酸与Romboutsia、Methylocaldum、Desulfobacca和Methylocystis的相对丰度呈负相关。肠道吸收葡萄糖对于机体至关重要，而对葡萄糖的吸收不足最终会影响鱼类的生长，葡萄糖与Alsobacter、Acinetobacter、Cyanobium PCC-6307和Turicibacter的相对丰度呈显著负相关，从而表明这四种微生物可能抑制罗非鱼肠道的葡萄糖代谢。Spearman相关热图表明，一些代谢物与某些属的相对丰度值呈显著正相关，但与另一些属的相对丰度值呈负相关。这一现象表明，前者产生的代谢产物可能对后者有抑制作用，这表明肠道代谢产物可能驱动细菌群落的结构，并以直接或间接的方式调节种群竞争。肠道微生物和代谢物之间有密切的相关性，例如Syntrophus的相对丰度与N-乙酰谷氨酸、4-氨基丁酸、十八烷酸和花生四烯酸呈负相关，但与半胱氨酸、天冬氨酸和蛋氨酸呈正相关。一些代谢物与微生物没有显著相关，而一些潜在的有益细菌的相对丰度值与大多数肠道代谢物呈正相关，如Undibacterium、Crenothrix、Cetobacterium。Undibacterium和Cetobacterium可能参与肠道代谢，Crenothrix可能参与甲烷氧化，并促进肠道去除甲烷。这些结果表明，这些潜在的有益微生物可能在促进肠道营养消化和代谢方面发挥重要作用。我们还观察到Mycobacterium、Desulfomonile、Escherichia-Shigella、Paeniclostridium、Aeromonas、Clostridium sensustricto 1、Alsobacter、Acinetobacter、Cyanobium PCC-6307和Turicibacter的相对丰度值与大多数肠道代谢产物呈负相关。这些属中的大多数细菌均为潜在的机会性病原体，因此，我们推测潜在有益微生物的丰度增加可能有助于改善肠道代谢功能，而机会性病原体的丰度增加可能会损害肠道代谢功能，在食物中补充益生菌或益生元可以重塑鱼的肠道微生物群。本研究揭示了特定的肠道微生物和代谢物之间的密切相关性，这可能有助于筛选靶向益生菌或益生元，并将其添加到饲料中，以调节肠道营养物质的消化和新陈代谢。然而，本研究并没有揭示代谢物和肠道微生物群之间的因果关系。我们对肠道内容物中大量的肠道微生物与相应的代谢物进行结合分析，为肠道微生物群的功能评价提供了良好的数据支持。我们的结果表明，肠道代谢物与碳水化合物、氨基酸、脂质、辅因子和维生素的代谢有关，这通常与肠道微生物群预测功能中的主要代谢途径一致。此外，胃肠道微生物群中约有66%的预测功能与代谢途径有关，特别是碳水化合物和氨基酸代谢有关，这支持了先前的共识，即鱼类肠道微生物群可能在宿主营养代谢中发挥重要作用。这些结果表明，肠道微生物群与肠道代谢物的组成或功能之间存在一致性。值得注意的是，消化样本相关微生物群的预测功能与黏膜样本相关微生物群有显著差异。与黏膜相关微生物群相比，消化相关微生物群中有四种代谢途径显著丰富。这一发现表明，消化相关微生物群在营养代谢中比黏膜相关微生物群起着更重要的作用；相反，黏膜相关微生物群中异生生物降解和代谢的途径明显比消化相关微生物群更丰富，这可能表明，与黏膜相关的微生物群具有降解外源性污染物或有毒物质的强大能力，从而保护黏膜组织免受外源性损伤，揭示了罗非鱼不同部位的微生物功能差异，从而进一步阐明了不同部位的共生微生物群的独特功能。

结论

本研究是首次全面描述成年尼罗罗非鱼鳃和胃肠道微生物群的分类和功能特征。结果发现，不同胃肠道区域和样本类型的微生物多样性、结构和预测功能有显著差异。嗜糖假单胞菌、R. pickettii、 Comamonadaceae、Staphylococcus在黏膜样本中显著丰富，而许多细菌菌群在消化样本中丰度较高，包括 Chitinophagaceae、Cetobacterium、Candidatus Competibacter、HOC36、methyloparacoccus和chloroplast。此外，Undibacterium、Escherichia-Shigella、Paeniclostridium、Cetobacterium普遍存在于肠道内容物与黏膜中，S.aquatilis、R. gilardii普遍在鳃和胃黏膜中。有趣的是，几种潜在的有益微生物的相对丰度值与大多数肠道代谢物呈正相关，而一些潜在的机会性病原体的相对丰度值与大多数肠道代谢物呈负相关。然而，这些相关微生物的潜在功能及其对宿主肠代谢的调节机制需要进一步研究。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33802740/   

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